11 Ekim 2016 Salı

Hedeflenmiş Yeni Nesil Sekanslama Yöntemleri

Yeni nesil sekanslama sistemleri araştırmacılara genomik, transkriptomik ve epigenomik alanlarında neredeyse aklına gelen bütün soruları sorabilecek yöntemler sunar. Yapılacak olan araştırmaya göre kütüphane hazırlama aşaması da oldukça değişmektedir. Genomik çalışmalarının en sık kullanılan yöntemlerinden biri de hedeflenmiş sekanslama (targeted sequencing)' dir. Bu yazımda ben de size bu yöntemden bahsedeceğim.

Bu yöntem genomun sadece bir bölümünü ya da belli gen kümelerini sekanslamak için kullanılmaktadır. Araştırmacılara çok yüksek kapsam (coverage) seviyesi sağlarken zaman kaybı ve giderleri azaltmaktadır. Örnek vermek gerekirse, bir tüm genom sekanslama çalışmasında kapsam değeri 30x-50x civarında olurken bu yöntem ile kolayca 500x-1000x ya da daha yüksek kapsam değerleri elde edilebilir. Bu yüksek kapsam değeri araştırmacılara nadir varyantları tanımlama konusunda yardımcı olur.

Hedeflenmiş sekanslama panelleri hazır tasarlanmış şekillerde alınabilir ya da özel olarak dizayn edilebilir. Günümüzde çok miktarda hazır panel bulunmaktadır. Bu paneller şu an yoğun olarak kalıtsal hastalıkların teşhisinde kullanılmaktadır. Aşağıda bu hazır panellere daha spesifik örnekler vereceğim. Hedeflenmiş sekanslama, 2 farklı yöntem ile yapılabilmektedir. Bunlar hedef zenginleştirme (Target Enrichment) ve  amplikon oluşturma (Amplicon Generation)'dur.

Hedef zenginleştirme temel olarak olta ile balık tutmaya benzemektedir. Eğer yakalamak istediğiniz özel bir balık türü varsa bunun için özel bir yem kullanmak gerekir. Hedef zenginleştirme yönteminde de hedeflenen genomik bölgeleri bu balıklara benzetebiliriz. Hedeflenen genomik bölgeleri elde etmek için biyotin ile işaretlenmiş 80-120 baz uzunluğunda problar kullanılmaktadır. Bu problar istenilen bölge ile hibridize olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu kısmı özel bir yeme benzetebiliriz. Daha sonrasında ortama eklenen streptavidin kaplı manyetik boncuklar (beads) biyotinlere bağlanır. Bu boncukların manyetik özelliğinden yararlanılarak hibridize olmuş bölgeler diğerlerinin içinden çekilerek elde edilebilmektedir. Bu yöntem ile kütüphane hazırlanması hedef zenginleştirme olarak adlandırılmaktadır.

Amplikon oluşturma ise temel olarak hedeflenen bölgelerin PCR ile çoğaltılmasına dayanmaktadır. Hedeflenen bölgeler için klasik veya multipleks PCR yapılır. Çoğaltılan bölgelerin saflaştırılmasıyla kütüphane hazırlanır. Amplikon oluşturma yönteminde temel zorluk primerlerin tasarlanmasıdır. Multipleks PCR için primer tasarımında primerler arası etkileşimlerin hesaplanması gerekmektedir.

Her iki yöntem de temel olarak aynı amaç için kullanılmaktadır. Yapılan araştırmalara göre ikisinin farklı avantajları bulunmaktadır. Gen sayısı az olduğunda amplikon oluşturma maliyet olarak büyük avantaj sunmaktadır. Gen sayısı arttığında ise hedef zenginleştirme kitleri kullanışlı olmaya başlamaktadır. Çünkü hem primerler arası etkileşimden dolayı verim düşmekte hem de primer sayısının artması nedeniyle maliyet artmaktadır. Karar vermek için gen sınırına 50 gen diyebiliriz. Genellikle kanser panellerinde hedef zenginleştirme yöntemi kullanılmaktadır. Örnek bir hedef zenginleştirme kanser kitine buradan ulaşabilirsiniz. Amplikon oluşturma kitleri ise genellikle tek gen hastalıklarında kullanılmaktadır. Amplikon oluşturma yöntemi deneysel çalışmalarda ve analiz kısmında hedef zenginleştirme yöntemine göre daha kolaydır.

Bütün bunlardan yola çıkarak yapılacak olan araştırmadan önce gerekli hesaplamaları yapıp uygun olan yöntemi seçmenin çok önemli olduğunu söylemek gerekir. Doğru yöntemi seçmek hem maliyet yönünden hem de zaman bakımından büyük kazanç sağlayacaktır.

Osman