2 Ocak 2014 Perşembe

Primer Tasarımı - 4 (BLAST ve Primer-BLAST)

Primer tasarımı üzerine paylaştığım yazı dizisinin son yazısıyla başlıyorum yeni yıla. Bu yazıda, primer tasarımının son halkası olan BLAST'tan (yani tasarlanan primerlerin genomda nerelere isabet edebileceğinden) ve bu doğrultuda hazırlanmış çok kullanışlı bir programdan bahsedeceğim. Önemli noktalara değinebilmek adına biraz uzun bir yazı hazırladım ancak sonuna kadar sabırla okuduğunuzda buna değecektir.

Her zamanki gibi işin teorik arka planı ile başlıyorum. Önceki yazılarda bahsettiğim hesaplamalar doğrultusunda ortaya birçok alternatif primer çifti çıkabilir, genomdaki bazı istisnai bölgeler dışında çoğu zaman elimizde birden fazla alternatif olacaktır. Ancak, elimizdeki her bir primer genomda herhangi başka bir bölgeye bağlanabilir mi? Eğer böyle bir ihtimal varsa, o primer gidip diğer istenmeyen/farkedilmeyen bölgeye de bağlanacaktır ve en iyi ihtimalle PCR reaksiyon verimi düşecektir. Daha kötü bir ihtimal ise, ortaya istenmeyen bir ürünün çıkmasıdır: eğer bu durumu fark edemediysek aslında istenmeyen bir bölgeyi çoğaltıp kendi hedef bölgemizi çoğalttığımızı düşünebiliriz. Bu nedenle, her primer çiftinin, çalıştığımız genomda nerelere bağlandığını dikkatli bir şekilde araştırmalıyız. Hatta bunu yaparken, tam eşleşmelerin/bağlanmaların [perfect match] yanı sıra, primerdeki bazı bazların tam bir hibridizasyon gerçekleştirmemesi durumunda bile primerin DNA'ya bağlanacağını göz önünde bulundurmamız lazım. Hatta şöyle bir örnek vereyim: primerin Taq Polimeraz'ın yerleştiği uçtaki yaklaşık 3 bazlık bağlanma tam olarak gerçekleştiği sürece, geri kalan kısımlardaki baz eşleşmelerinin bir kısmı tam olarak gerçekleşmese bile bu PCR reaksiyonu gerçekleşecek ve o DNA bölgesi çoğaltılacaktır. Somutlaştırayım: 20 bazlık bir primerin bazen yarısı (toplamda 10 baz) dahi tam olarak bağlanmasa bile reaksiyon verimi çok düşük olsa bile reaksiyon gerçekleşebilir. Eğer primerin tam olarak bağlandığı bölgeden bir ürün çıkıyorsa, diğer düşük verimli bölgelerden çıkacak ürün miktarını gölgeleyecektir. Aksi durumda ise - o gün üzerimizde yeterince şanssızlık varsa - ortaya kayda değer miktarda ürün çıkmış bile zannedebiliriz.

Peki primerin çalıştığımız genomda nerelere bağlanabileceğini nasıl bulabiliriz? Bir Word belgesi üzerinde çalışırken bulmak istediğimiz kelimeyi Ctrl+F (Find) ile bulabiliriz, ancak bu durumda tam bir eşleşmenin olması gerekir. Yani, mesela aradığımız kelime "informatik" ise, ancak bu kelimeyi içerisinde aradığımız metinde bu kelime "enformatik" olarak geçiyorsa, Ctrl+F (Find) bize yardımcı olamaz. Genomda ise bu duruma çok sık rastlarız: polimorfizm olarak adlandırdığımız ve aynı türde bile bir canlıdan diğerine göre değişiklik gösteren bir çok nükleotit değişimi vardır. İnsanda bu sayının 10 milyon civarında olduğu tahmin edilmektedir; yani ortalama her 300 bazdan biri kişiden kişiye değişiklik göstermektedir. Bu nedenle, tam eşleşmenin aranmasından daha esnek bir yönteme ihtiyacımız var, birçok alternatif arasından en güvenilir sonucu verdiğini düşündüğümüz yöntemin adı BLAST [Basic Local Alignment Search Tool]. Yöntemin detayına ulaşabileceğiniz bir çok kaynak var, bu nedenle bu yazıda detaya girmiyorum. Özetle bu yaklaşım bize mükemmel olmayan eşleşmelerin dahi bulunabilmesi ve bir referans ölçüye göre puanlanabilmesi imkanı sağlıyor. Primer tasarımında ise yapmaya çalıştığımız şey tam olarak bu: tasarladığımız alternatif primer çiftleri genomda başka nerelere mükemmel olmasa bile bağlanabilir?

Bundan yaklaşık bir sene öncesine kadar dünyada primer tasarımı iki aşamada gerçekleştiriliyordu: 1) alternatif primer çiftlerinin hedef bölgeye uygun olacak şekilde bir yazılımla tasarlanması ve 2) bulunan alternatif primer çiftlerinin BLAST ile genomda nerelere bağlandığının tespit edilmesi. İlk aşama aslında kendi içerisinde birçok zorluğu barındırıyor, çünkü bir bölgeye yönelik onlarca alternatif primer çifti tasarlayabilirsiniz (yazının ilerleyen kısımlarında göreceksiniz). Bunların da her birini teker teker BLAST kullanarak çalışacağınız genomda aramalısınız, ki bu çok zaman alan bir süreç. Bu nedenle çoğu zaman içgüdülerinizle bir bölge belirleyip ortalama bir primer çifti bulmaya çalışırsınız ve en iyi primer çiftini çoğu zaman gözardı etmek zorunda kalırsınız. İlk aşamayı gerçekleştireceğiniz birçok yazılım var ve ticari olmayanların -yani bedava olanların- en iyisi Primer3Plus. İkinci aşama içinse neredeyse tek alternatifiniz NCBI bünyesinde yer alan BLAST adlı araç. Bu durum 2012 Haziran'ına kadardı, artık daha iyi bir seçeneğiniz var. Bu yazı dizisinin en faydalı paragrafına geçiyorum.

Primer3 ile BLAST'ı birleştirip primer tasarımını tek bir aşamada gerçekleştiren bir yazılım hazırlandı Haziran 2012'de, ismi Primer-BLAST. Eğer insana ait bir bölgeyle çalışıyorsak tek yapmanız gereken PCR Template başlıklı metin kutusuna çoğaltmak istediğiniz hedef DNA bölgesini veya hedef genin erişim kimliğini [gene accession ID] yazmak ve sayfanın en altında yer alan Get Primers butonuna basmak. Hedef gen bölgesine en uygun alternatif primer çiftleri BLAST aramaları yapılmış şekliyle karşımıza çıkacak ve en iyi 5 tanesi önümüze gelecek, Tm (erime sıcaklığı) değerleriyle birlikte. Fazlasıyla kolay. Ancak bu blogu takip eden dikkatli ziyaretçilerimin aklına bazı soru işaretleri gelecektir, hele de bu yazı dizisine ait önceki 3 yazıyı okumuşlarsa. Bu noktalardan bahsedip, sizin sıradan bir internet kullanıcısı ile aranızdaki farkı oluşturan kısımlara değineyim aşağıdaki paragraflarda.


Primer-BLAST'ın karşımıza çıkan arayüzünde dikkatimizi çekmesi gereken bazı seçenekler var, bunların en kritik olanlarına bir göz atalım:

Primer Parameters başlığı altında:
1) PCR product size: Primer çiftleri tasarlanırken, İleri [forward] ve geri [reverse] primerler arasında kalacak olan ve PCR deneyiyle çoğaltılacak olan bölgenin kaç baz olması gerektiğine burada karar veriyoruz. Varsayılan [default] değerler asgari [minimum] 70 baz, azami [maximum] 1000 baz. Biliyoruz ki, Sanger metoduyla dizilimleme [sequencing] yaparken en uygun PCR ürünü uzunluğu 500 civarındadır. Bu nedenle sizin de 1000 olan Max değerini 500 olarak değiştirmenizi öneriyorum. Hele ki bu PCR ürününü Yeni Nesil Dizilimleme [Next Generation Sequencing] teknolojisi ile dizilimleyecekseniz [sequencing] Max değerini 250 veya altına indirmeniz gerekebilir. Min değerini Max değerine yakın bir değerde (mesela Max değerinin 50 eksiği kadar) seçerseniz de programı biraz daha kısıtlamış olursunuz ve birbirine yakın uzunlukta PCR ürünleri elde edersiniz. Yalnız bu durumda hiç bir sonuç alamama ihtimaliniz de var, bu değişikliği aşamalı olarak birkaç seferde yapmanızı öneririm.

Primer Parameters başlığı altında:
2) # of primers to return: İngilizcede # işareti sayı [number] kelimesinin yerine kullanılır; buradaki kutucuğa da en uygun primer çiftlerinden kaçının sıralanması gerektiği bilgisi giriliyor. Varsayılan [default] olarak 5 girilmiş, ancak size önerim bu değeri 10 ile değiştirmeniz. Belki tasarım süresini 30 saniye kadar uzatabilir (toplam tasarım süresi genelde 90 saniyeyi geçmez) ancak elinizde birçok alternatif primer çifti bölgesi olacaktır. En üstteki en iyi primer çifti olsa da, diğer seçeneklerde PCR ürün uzunluğu veya Tm (erime sıcaklığı) değeri açısından size daha uygun alternatifler yer alabilir. Özel bir sebebiniz yoksa ilk primer çiftini kullanmanızı öneririm.

Primer Pair Specificity Checking Parameters başlığı altında:
3) Organism: Burada, tasarlanacak olan primer çiftlerinin BLAST ile hangi türe ait canlıda aranacağını seçiyorsunuz. Yani, eğer fare (Mus musculus) ile çalışıyorsanız, tasarladığınız primer çiftini fare genomunda aramalısınız. Primer-BLAST aracında da BLAST işlemi primer tasarımıyla bütünleşik bir şekilde gerçekleştirildiğinden, çalıştığınız hedef genomu da bu kısımda belirtmeli ve çalışmanıza uygun bir şekilde seçmelisiniz.

Tm değerinin hesaplanmasıyla ilgili yazımı okuyanlar, bunun bu kadarla sınırlı olmaması gerektiğini hatırlayacaktır. Şimdi Advanced parameters linkine tıklayarak gelişmiş ayarlarla oynamaya başlayacağız:

Advanced parameters seçeneğiyle çıkan bölümdeki Primer Parameters başlığı altında:
4) Concentration of monovalent cations: Potasyum (K+) vb. katyonların milimolar cinsinden konsantrasyonlarının yazıldığı bu bölüm Tm değerinin hesaplanmasında kritik bir öneme sahip. Potasyum, KCl olarak deneyimize dahil olabilir ve genelde de kullandığımız hazır karışım [master mix] ile PCR tüpüne girer. Bu değerin çalışmanızda kullandığınız sarf malzemeleri -ve özellikle hazır karışım [master mix]- doğrultusunda girilmesi büyük önem taşır. Bu değer yanlış girildiğinde Tm değerinde birkaç derecelik sapmalara neden olabilir; belki de PCR deneyiniz bu nedenle tam verimle çalışmıyordur.

Advanced parameters seçeneğiyle çıkan bölümdeki Primer Parameters başlığı altında:
5) Concentration of divalent cations: Magnezyum (Mg++) vb. katyonların milimolar cinsinden konsantrasyonlarının yazıldığı bu bölüm bence en kritik bölüm. Bunun temel nedeni, magnezyumun aynı anda hem Tm değeri, hem de Taq Polimeraz'ın etkinliği üzerinde bir etkiye sahip olması. Magnezyum, Taq Polimeraz'ın kofaktörüdür [co-factor] ve bu nedenle polimerazın etkinliği doğrudan magnezyum konsantrasyonuyla ilişkilidir, bazı durumlarda polimerazın daha iyi çalışması için deneye eklenmelidir. Ancak ortamdaki magnezyumun konsantrasyonunun artması, çift zincirli DNA'nın daha kararlı hale gelmesine ve daha zor ayrılmasına neden olur: bu nedenle Tm değeri artar. Magnezyumun Tm üzerindeki etkisi, potasyumun etkisinden daha büyüktür ve bazı durumlarda Tm değeri çok daha büyük bir şekilde etkilenir/artar. Magnezyumun PCR deneyi üzerine etkilerinin mantığı genelde iyi bilinmez ve MgCl biraz ezbere bir şekilde kullanılır; bu konuda PCR konulu Wikipedia makalesinin Magnezyum Konsantrasyonu [Magnesium Concentration] başlıklı bölümünü mutlaka ama mutlaka okumanızı ve bu konuyu iyi anladığınızdan emin olmanızı şiddetle tavsiye ediyorum. Eğer deneyinizde magnezyum kullanılmıyorsa (PCR karışımınızda veya kullandığınız sarf malzemelerinde MgCl vb. yoksa) burayı sıfır olacak şekilde değiştirmeyi unutmayın.

Advanced parameters seçeneğiyle çıkan bölümdeki Primer Parameters başlığı altında:
6) Concentration of dNTPs: Bu kısımda yer alan değer sadece ortamda magnezyum olduğunda dikkate alınıyor. Yani, bir önceki paragrafta bahsedilen bölümde magnezyum konsantrasyonuna ilişkin bir değer girilmişse buraya da deneyde kullanılan dNTP konsantrasyonu girilmeli. Aksi takdirde -yani deneyde magnezyum vb. divalent katyonlar yoksa- buraya girilen değer herhangi bir hesaplamada dikkate alınmıyor.

Burada primer tasarımına ilişkin yazı dizime son verirken bir noktayı hatırlatmamda fayda var: PCR birçok farklı durumda farklı amaçlarla kullanılmaya gayet uygun bir deneysel yöntem ve tam da bu nedenden ötürü her bir durumun kendine has özellikleri var. Bu yazı dizisinde genel amaçlı bir PCR deneyine yönelik önemli noktalardan bahsetmeye çalıştım ancak sizin çalışmanız daha özel ve daha farklı seçimler gerektirebilir. Verdiğim eğitimlerde bu tarz farklılıklardan da yeri geldikçe ve soru soruldukça bahsetmeye çalışıyorum ancak bu blogda takdir edersiniz ki her türlü ince detaya girmek çoğu zaman mümkün olmuyor; bu yazı bile sıkıcı olabilecek kadar uzadı :) İnternetteki kaynaklar her ne kadar İngilizce olsa da mümkün olduğunca Wikipedia başta olmak üzere PCR ve primer tasarımı üzerine okumanızı öneriyorum. Tabii ki her zaman teori pratikle uyuşmayabilir ve çok iyi bir tasarım deney tüpünde hüsranla sonuçlanabilir. Ancak belli başlı kurallara dikkat ettiğinizde başarısızlık şansınızın fazlasıyla azalacağını rahatlıkla söyleyebilirim.

Bu yazı dizisini ve burada bahsettiğim Primer-BLAST adlı aracı faydalı bulursanız, sizden ricam bunları meslektaşlarınızla da paylaşmanız. Kısa vadede bakıldığında sizin PCR deneylerinizin çalışıp yan tezgahtaki [bench] meslektaşınızın PCR deneylerinin çalışmaması sizi grubunuzda/labınızda parlatacak olsa da, uzun vadede bu durum ülkemiz açısından pek de sürdürülebilir bir durum değil ve eninde sonunda sizi olumsuz olarak etkileyecektir (ileride sizin grubunuzda çalışmak isteyen potansiyel öğrencilerinize her şeyi baştan anlatarak toplamda yıllarınızı ve binlerce liralık sarf malzemenizi kaybetmenizden bahsediyorum). Bu yazıyı, yazı dizisini veya Primer-BLAST'ı faydalı bulduysanız, bunu paylaşmanızı sizden özellikle rica ediyorum, dikkate alırsanız memnuniyet duyarım :)

PCR deneylerinizin her zaman istediğiniz şekilde çalışması dileklerimle.


Sözün Özü:
Parametreler tasarladığınız deneye uygun seçildiği sürece mevcut primer tasarlama araçları arasında her aşamayı tek bir çatı altında gerçekleştiren yegane araç Primer-BLAST hem ücretsiz, hem de kullanımı kolay bir primer tasarım aracıdır. Bu aracı kullanırken ilgili parametrelerin değerlerini doğru olarak girdiğinizden emin olmalısınız. Bu aracı veya yazı dizisini faydalı bulursanız lütfen faydalanabilecek diğer meslektaşlarınızla paylaşmaktan çekinmeyin.



Proje:
SPRR4 genine uygun bir primer çifti tasarlayın. Bunun için yapmanız gereken şey, Primer-BLAST'ın web sayfasına girip PCR Template başlığı altındaki metin kutusuna bu genin DNA dizilimini [sequence] veya bu genin RefSeq numarasını (NM_173080.1) kopyalayıp yapıştırmak. Yukarıda bahsettiğim parametrelerle ve özellikle de magnezyum (divalent katyon) konsantrasyonuyla oynadığınızda ne tarz değişiklikler oluyor, Tm değeri nasıl değişiyor, farklı primer çiftleri de karşınıza çıkıyor mu?

Meraklısına:
Bir primer tasarım programı geliştirmek güzel bir programlama alıştırması olabilir. Primer-BLAST'ın altyapısını oluşturan Primer3 yazılımının açık kaynak kodunu sourceforge'da bulabilirsiniz.